课后答疑丨昆虫杆状病毒系统在基因治疗病毒载体、蛋白及疫苗中的开发和应用

提问：关于细胞复苏问题，为了避免形成冰晶破坏细胞壁，建议复苏细胞一分钟内融化；但有些研究人员建议复苏的时候融化一半，另一半用37度培养基溶解，这样水浴里不完全溶解能够避免37度环境中DMSO的细胞毒性。这俩个说法好像都有道理，该怎么取舍？

回答：一般来说，快速解冻以防止冰晶形成是更为的做法，建议水浴冻存管复苏到一颗绿豆大小的小冰晶即可。但如果您的细胞对DMSO非常敏感，第二种复苏方法可能更为合适。除此之外也可以选择专业的细胞复苏仪。

提问：细胞于培养基适应性培养，做几次传代会出结果？

回答：一般来说至少3代以上，不同细胞会有较大差异，建议每次传代都要进行细胞冻存。如您对细胞悬浮驯化或新培养基适应还有疑问，请联系我们。

提问：昆虫细胞大规模生产AAV中，对于不同AAV亚型，上游工艺的选择有什么不一样？

回答：对于One-Bac 4.0系统，劲帆建立了完整的AAV平台工艺，不同的血清型会根据AAV的CQA的检测指标，进行上游CPP调整，如batch/Fed-batch、MOI等策略选择。

提问：关于流加工艺可以再多介绍一下吗，流加策略怎么确定？

回答：流加策略影响因素有补料量、补料时间、频率、细胞密度等，一般会参考细胞代谢的数据，设计多因子DOE实验而定。（关于工艺优化更多内容可看直播回放）

提问：昆虫杆状病毒系统制备流感疫苗，一般选择哪些抗原？

回答：可以选择HA,也可以选择VLP。

提问：劲帆医药的sf9细胞是去弹状的吗？

回答：是去弹状病毒的。

提问：昆虫表达流感抗原糖型不均一如何优化呢？

回答：可以尝试改变发酵条件，或者在有些文献中提到可以采取基因工程手段，如敲除或敲入特定的糖基转移酶，以改变昆虫细胞的糖基化模式。

提问：抗体翻译后修饰，糖基化会影响抗体药效果，您提到昆虫平台生产的蛋白没有末端唾液酸修饰，那其他蛋白修饰会不会影响抗原质量，怎么控制呢？

回答：选择不同发酵表达系统，就会有不同蛋白修饰，如原核表达系统（如大肠杆菌）无法进行糖基化和蛋白折叠，不适用于表达复杂蛋白质。不同项目在初期时就应评估不同的发酵系统差异性来进行选择表达系统，当然也可以委托劲帆医药来测试不同表达系统的蛋白。

提问：杆病毒表达的重组蛋白是包涵体，是什么原因呢？怎样才能提高蛋白可溶性？

回答：蛋白短时间大量表达、蛋白可溶性差等原因会形成包涵体；优化启动子，使用促溶标签，尝试不同的信号肽等措施提高可溶性。

提问：跨膜蛋白表达如何保证充分裂解细胞，获得细胞膜上的重组蛋白？

回答：对于跨膜蛋白，可能需要使用不同的细胞裂解条件来确保充分裂解。例如，可以使用RIPA裂解缓冲液、RIPA加超声处理或者跨膜蛋白提取试剂。

提问：使用昆虫杆状病毒表达重组蛋白表达量很低不足5mg/L，如何提升产量？

回答：选择合适的启动子，密码子优化，发酵工艺优化。

提问：昆虫细胞表达圆环蛋白表达量是多少？

回答：目前行业内发酵的初产至少在 100mg/L。